固体培养10～15天的淡黄色疏松湿润的愈伤组织适宜进行悬浮培养。适宜培养基是B5＋NAA1＋2，4-D1＋KT0.5＋CH0.2%，温度为(25±2)℃。悬浮培养过程中按新鲜培养液：原细胞培养液为2∶1的比例加入条件培养基能有效促进细胞的生长；悬浮培养的细胞接种密度以1.5 g FW/45 ml瓶为适。
［17］Park H H.Takamatsuka et al. 1995,Rapid metabolism of islfavonoids in elicitortreated cell supension cultures of Pueraria Lobata［J］.Phytochemisty: 38(2):373380.
野葛(Pueraria lobata(Wild.)Ohwi)为豆科葛属(Pueraria DC.)多年生落叶草质藤本植物，地方名为葛藤。现代医学表明葛根有效成分葛根素(puerarin)等异黄酮类(isoflavones)物质具有治疗急性心肌梗塞、不稳定性心绞痛、高粘血症、急性脑梗塞、颈椎病，对东莨菪碱和乙醇引起的记忆障碍有对抗作用等［1～5］。我国葛属资源较为丰富，野葛为广布种，以葛属植物特有的有效成分葛根素及总异黄酮评价葛根质量，野葛中药用成分含量显著高于同属其他植物［6］。
1野葛组织培养研究现状
1.1组织培养和植株再生研究刘慧丽等对野葛愈伤组织培养的适宜条件的研究结果表明：野葛的根、茎、叶、子叶外植体均能在MS＋CPPU 0.5 mg/L(单位下同)的培养基上诱导愈伤组织，适宜的外植体材料是子叶和叶，根的愈伤组织诱导率最低。愈伤组织最佳断代培养基为B5＋NAA1＋2，4-D1＋KT0.5。不同外植物体来源的愈伤组织生长曲线呈～S'形，茎、叶、子叶愈伤组织的生长周期约为20 d，根愈伤组织的生长周期则为28 d左右。愈伤组织的最适继代时间约为20 d［6］。
于树宏等［7］对野葛的组织培养和植株再生的究结果表明，愈伤组织的最适诱导培养基为MS＋NAA1.0＋BA3.0，成熟叶片最适于诱导愈伤组织，其次为幼嫩的茎段；丛生芽的诱导与增殖最适培养基分别为MS＋BA2.0＋AgNO3 4.24 g/L，MS＋4-PU0.5；诱导不定根的最适培养基为MS＋NAA1.0；壮苗的最适培养基为MS芽＋PP333 1.0 mg/L。
施和平等［8］对三裂叶野葛茎段和叶柄培养成再生植株的研究表明，叶柄和茎段外植体愈伤组织的最适诱导和继代培养基为MS＋2，4-D1.0＋KT0.1+6-BA0.5；愈伤组织分化的最适培养基为MS＋6-BA3.0＋NAA1.0；芽分化的最适培养基为MS＋6-BA1.0＋NAA0.1；最适生根培养基为MS＋NAA0.1；叶柄的组织培养和植株再生效果比茎段更好。比较野葛不同外植体再生植株的效果，野葛组培快繁材料以选取叶柄最合适。
李铃等［6］对三裂叶野葛愈伤组织形成的研究表明：三裂叶野葛无菌苗器官在MS＋NAA1＋2，4，5-T1培养基上培养皆能形成愈伤组织，以子叶的诱导频率最高，这与刘慧丽等的研究结果一致。B5＋2，4-D1＋NAA0.1＋CH300为愈伤组织继代培养的最适培养基。
1.2生长素和细胞分裂素物质对野葛外植体形态发生的研究刘传飞等通过比较几种生长素和细胞分裂素物质对野葛外植物体态发生的影响发现，BA诱导的不定芽数量和质量均好于KT，最适浓度1 mg/L，同样浓度的BA比KT易使野葛外植体基部膨大和褐化，KT比BA更易使不定芽玻璃化，提高BA浓度或者不定芽在含BA或KT的培养基上继代，也会产生玻璃化和褐化，随继代次数增加而加重。在3种生长素类物质IAA、IBA和NAA诱导不定根形成过程中，在0.2 mg/L以下，NAA诱导的效果最好，在0.3～0.4 mg/L的浓度范围内，IBA效果最好。而大于0.5 mg/L的浓度则LAA效果最好，在同样浓度条件下，NAA诱导不定根粗短，而IBA和LAA诱导的不定根细长，多分枝，形态上较接近自然根。3种生长素类物质诱导愈伤组织和褐化能力依次为NAA＞IBA＞IAA，低浓度下生长素质诱导的不定根生长快、生长质量好，幼苗移栽成活率高，而过高的生长素物质诱导的根系粗短，易褐化和形成愈伤组织、幼苗移栽不易成活，反映不定根与外植体维管束联系差。当BA与IBA混合使用时，BA会严重抑制BA诱导的不定根形成，而IBA对BA促进的不定芽分化效应作用不明显，一般产生不定芽和不定根的适宜浓度配比为BA0.5＋IBA0.3［9］。
1.3发根农杆菌诱导毛状根的研究刘传飞等利用含超强毒性基因的发根农杆菌R1601转化野葛、山葛和三裂叶野葛离体叶片，研究结果表明：在叶片表面直接形成毛状根并能够合成葛根素，毛状根离体培养后均出现两种形态：一种是有较高葛根素含量的典型毛状根，另一种是葛根素含量低但生长速率较快的愈伤组织化毛状根。两类毛状根均有rolB基因存在，表明rolB基因对所有毛状根的诱导和生长是必需的。auxl存在于所有愈伤组织化毛状根，而在典型毛状根中的检出率为20%～50%，表明auxl基因有诱导毛状根产生愈伤组织的作用。含有ags基因的毛状根葛根素含量低于不含ags基因的毛状根葛根素含量，表明ags基因不利于次生代谢物合成。毛状根的诱导频率分别为16.6%，16.2%，26.6%。三种药用葛毛状根均表现出生长快、多分支、负向重力性的典型特征。毛状根离体培养均具有激素自主特性的抗卡那霉索特性，毛状根的冠瘿碱纸电泳、rol基因扩增及分子杂交实验均证实了其转基因性质［10～12］。
于树宏等利用发根农杆菌R1601菌株感染野葛叶片外植后获得的毛状根经连续4次继代培养，鲜重增加到最初的6.2倍。pH为5.5的1/2 SH液体培养基较适合野葛毛状根的生长，与自然相比，毛状根在无激素的1/2 SH液体培养基中离体培养20 d后，鲜重增加22.6倍，释放入培养液中的异黄酮量增加10.6倍。毛状根生产异黄酮的量略高于自然根，且根中含量明显高于愈伤组织及茎中异黄酮的含量。培养液体积影响毛状根的离体生长及异黄酮的释放。发根农杆菌R1000对野葛的遗传转化及其影响因素的初步研究表明：叶片是转化效率较高的外植体，经发根农杆菌R1000感染13 d左右可获得毛状根，毛状根诱导率及诱导密度分别为17.9%和3.9；降低YEB活化液的pH值，或以肌醇(10 g/L)代替酵母提取成分，可明显提高该菌种的致根性；叶片预培养2～3天可提前4天出根［13～15］。
施和平等［16］对三裂叶野葛毛状根的诱导及其固体培养和液体培养研究的结果表明：发根农杆菌ATCC15834感染三裂叶野葛叶片外植体20 d后产生毛状根，毛状根可直接从叶片外植体叶脉处或从叶脉处产生的愈伤组织上产生。感染35 d后，约85%的叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长。PCR扩增结果表明，发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在三裂叶野葛毛状根基因组中整合并得到表达。与固体培养的毛状根相比，在液体培养基中培养的毛状根不仅生长迅速，也不会形成愈伤组织。在无外源生长调节剂的液体MS培养基中培养15 d的三裂叶野葛毛状根的鲜重、干重、可容性总糖含量及细胞内活性氧(ROS)含量分别为固体培养毛状根的1.59，1.18，5.25倍和1.16倍。
梁棚等［16］对发根农杆菌ATCC15834对三裂叶野葛叶片外体植体遗传转化的研究表明：发根农杆菌ATCC15834感染三裂叶野葛叶片外植体20 d后产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体或液体培养基上自主生长。PCR结果证实，发根农杆菌Ri质粒的rolC基固已在三裂叶野葛根素含量分别是非转化根的1.6和5.1倍。
1.4愈伤组织、细胞悬浮培养产生异黄酮类化合物研究张春荣等以野幼叶愈伤组织建立悬浮细胞培养体系的研究结果表明：野葛未成熟种子萌发获得的无菌苗幼叶在含NAA1，BA2的固体培养基上诱导愈伤组织，愈伤组织在含4-Pu0.5的MS固体培养基上继代形成结构疏松、生长迅速的淡黄色愈伤组织，接入B5＋2，4-D1＋NAA1＋KT0.5＋CH0.2%液体培养基中振荡培养，在悬浮培养条件为(25±2)℃、全天光照，光强5.34 μmol/m2，摇床转速110～130 r/min的环境下建立颗粒均一、分散良好、生长迅速的野葛幼叶细胞悬浮培养体系。
野葛悬浮细胞的生物量在培养的第8天达最大值，为12.58 mgDW/L，细胞产率为72.18%。悬浮细胞中葛根素的合成与细胞生长呈紧密偶联型，第8天时细胞和培养液中的葛根素含量达最大值，分别为7.98 mg/gDW和3.46 mg/L，此时细胞和培养液中葛根素积累的动力学曲线。野葛细胞接入新鲜培养液后，总异黄酮类化合物随细胞的生长而不断合成、积累，细胞进入稳定期后，总异黄酮类化合物的积累速度反而加快，第10天达最大值，为129.05 mg/gDW，此时细胞和培养液中异黄酮类化合物的总产量为1.59 g/L。野葛幼叶悬浮细胞中总异黄酮类化合物的最高含量超过野生葛根含量(68.7 mg/gDW)，而葛根素最高含量则低于野生葛根含量(12.6 mg/gDW)。野葛幼叶悬浮细胞及培养液中葛根素含量占异黄酮类化合物总含量的9.22%［6］。
刘慧丽等研究了野葛愈伤组织培养和细胞悬浮培养的适宜条件，比较了不同器官来源的野葛愈伤组织中的有效成分含量，筛选建立生长快速稳定的野葛悬浮细胞系，并探讨了野葛细胞生长与异黄酮类物质积累之间的关系。其研究结果表明：在一个生长周期内，不同来源的愈伤组织中异黄酮和葛根素的含量随细胞生长逐渐积累，愈伤组织生物量达到最大值时含量也达到高峰，次生代谢物积累与细胞生长呈相关，以根愈伤组织的有效成分含量最高，其次叶、茎、子叶最低。各种愈伤组织在一个生长周期内总黄酮含量约增加1.6倍左右，葛根素含量增加约2.6倍左右。光照不利于愈伤组织生长，但有利有效成分积累。弱散光下的浅黄色愈伤组织生长最好，产生的有效成分含量也较高。
固体培养10～15天的淡黄色疏松湿润的愈伤组织适宜进行悬浮培养。适宜培养基是B5＋NAA1＋2，4-D1＋KT0.5＋CH0.2%，温度为(25±2)℃。悬浮培养过程中按新鲜培养液：原细胞培养液为2∶1的比例加入条件培养基能有效促进细胞的生长；悬浮培养的细胞接种密度以1.5 g FW/45 ml瓶为适。
野葛子叶悬浮细胞的生长周期约为一周，细胞生产前两天为迟滞期，第2天后进入对数期和快速生长期，对数期内细胞的倍增时间为41.3 h，第7天后细胞生物量达到最大值，之后开始缓慢下降。适宜的继代时间为7 d，细胞生长曲线呈“S”形。子叶细胞有效成分含量变化与生长呈正相关，其中总黄酮含量高于固体培养的愈伤中的含量，但葛根素的含量却低于愈伤组织中的含量。悬浮细胞培养液中有效成分含量很低［6］。
1.5诱导子对黄酮类化合物产生的研究Park等［17］以酵母提取物为诱导子研究对野葛细胞次生代谢的影响，并证明生物合成异黄酮类化合物所需的酶是由酵母提取物诱发而从头合成的。
梁棚等研究了培养基中蔗糖浓度、Ca2＋浓度及光对三裂叶野葛毛状根生长及其异黄酮类化合物产生的影响，其研究结果表明：较高浓度的蔗糖有利于毛状根生长，培养16 d后，毛状根在含5%，4%，3%蔗糖的MS培养基中的干重增殖倍数分别为11.7，11.9，10.1；而在含2%蔗糖的培养基中的干重增殖倍数仅为5.9。与毛状根培养物的生长曲线相似，毛状根培养物中的异黄酮类化合物含量，随着毛状根培养物的生长而不断提高。其中3%蔗糖浓度有利于毛状根中异黄酮类化合物及葛根类的积累，毛状根的葛根素含量在培养12 d后达到最高约5.147 mg/gDW；而培养16 d后，其异黄酮类化合物的含量最高，约27.76 mg/gDW。在毛状根生长的停滞期，培养基中蔗糖的消耗速度缓慢：在快速生长时期，培养基中蔗糖消耗迅速，同时毛状根中可溶性总糖含量也逐渐增高，至培养12 d后达到最高；在毛状根生长的平台期(培养16 d后)，培养基中蔗糖几乎消耗完。
毛状根在外加Ca2＋专一整合剂EGTA的MS培养基中不能自主生长，而培养基中钙离子浓度为5.986、8.979 mmol/L时，则明显抑制毛状根的生长及其葛根素的积累，但却有利于毛状根培养物中异黄酮类化合物的积累。
与暗培养相比，蓝光和白光都明显抑制三裂叶野葛毛状根培养物的生长，其干重分别比暗培养下降了27.04%和18.87%；但却能提高毛状根中异黄酮类化合物的含量，其中尤以白光处理的作用最明显，白光下培养的毛状根培养物中的异黄酮类化合物含量分别比蓝光、暗培养提高了17.2%和23.7%；蓝光和白光下培养的三裂叶野葛毛状根的表面呈淡绿色，而暗培养的三裂叶野葛毛状根呈淡红褐色或白色［15］。
张春荣等以野葛幼叶愈伤组织建立悬浮细胞培养体系，研究了有机附加物椰乳、水解酪蛋白(CH)、酵母的取物(YE)、脱乙酰几丁质(DC)，诱导子SA、MJ、乙烯利，有机溶剂DMSO、Tween-20、Triton等对野葛细胞生长和异黄酮类化合物生产的影响。其研究结果表明，过滤灭菌的椰乳和高压灭菌的椰乳的作用效应不同。10%(v/v)椰乳对野葛幼叶悬浮细胞的生长及次生长代谢物的积累具有一定的抑制作用。0.2%的水解酪蛋白对野葛幼叶悬浮细胞的生长及葛根素和总异黄酮类化合物的积累和释放均有促进作用，可使葛根素和总异黄酮类化合物的产量分别提高34.05%和40.76%，野葛细胞悬浮培养的最适培养基为B5＋2，4-D1＋NAA1＋KT0.5＋CH0.2%。
YE和DC对野葛幼叶悬浮细胞的生长均无促进作用，较高浓度(0.5 g/L)的DC处理较长时间(5 d和8 d)抑制细胞的生长。YE加到悬浮细胞培养液后，引起细胞轻微褐化。YE不利于野葛悬浮细胞中葛根素产量的提高。以0.01 g/LDC处理8 d对葛根素的增产效果最大(增产28.40%)。YE和DC对野总幼叶悬浮细胞中异黄酮类化合物的积累及总产量提高均无促进作用。
SA、MJ和乙烯利对野葛幼叶悬浮细胞的生物量没有明显促进作用。SA和MJ能引起细胞褐化，而乙烯利则能较好地保持细胞活力。各种浓度的SA和低浓度(0.1 mg/L和1 mg/L)的MJ对葛根素总产量的影响不大，1 mg/LMJ处理8 d和5 d略微促进葛根素的生产，而0.1 mg/L乙烯利处理3 d能显著提高葛根素的总产量(增产27.37%)。SA、MJ和乙烯利对野葛悬浮细胞异黄酮类化合物的生产没有促进作用。
浓度在1%～5%(v/v)范围内的DMSO即使处理5 d也不影响细胞的活力，浓度在1%～5%(v/v)范围内的Tween-20和Triton X-100处理3 d内对细胞活力的影响较小。三种有机溶剂均能促进细胞中葛根素及其它显著促进总异黄酮类化合物的释放，但均不利于葛根素的生产。5%(v/v)的Triton X-100处理3 d能够显著促进总异黄酮类化合物产量的提高，增产率达40.56%［17］。
李铃等［17］对三裂叶野葛异黄酮类化合物的研究表明不同外植体形成的愈伤组织经继代培养产生异黄酮和葛根素的能力在不同时期各不相同。
2展望
由以上研究成果来看，目前国内对野葛细胞培养及其次生代谢产生的研究已经有了一定的深度，但对野葛细胞培养生产次生代谢物的动力学研究以及诱导子对其次生代谢影响方面的研究较为肤浅，离工业化生产还有很大一段距离。建议将如下内容作为今后对野葛细胞培养研究的重点：细胞生长与产物积累的动力学研究、次生代谢调控、植物次生代谢的分子生物学及基因工程研究(包括将控制特殊代谢产物产生的基因转入到微生物等其它生物体中并得到高效表达)以及协调实验室研究与放大工业化生产之间的配套，即重视中试研究［18］。
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