超级杂交稻分子育种研究

    上世纪60年代世界主要产稻国通过广泛推广应用矮秆高产品种，水稻大面积产量得到了大幅度提高，史称“绿色革命”。 我国继通过矮化育种实现了水稻单产的第一次飞跃后，又于20世纪70年代应用三系法杂交水稻育种，实现了我国水稻单产的第二次飞跃。然而，此后出现的水稻品种产量潜力徘徊局面，一直到20世纪90年代中叶都未得到明显改善，全世界的粮食安全问题受到了广泛的关注。
    为争取早日实现我国水稻单产第三次飞跃，我国科学家在总结国内外经验和教训的基础上，于1996年提出了实施我国水稻超高产育种（超级稻育种）设想：即采用理想株型塑造与籼粳杂种优势利用相结合的技术路线，大幅度提高水稻单产。经多年努力，中国超级稻育种，尤其是超级杂交稻育种取得了重大突破，三系法杂交稻协优9308、II优明86、两系法杂交稻两优培九等新组合在百亩、千亩连片规模上亩产700公斤，小面积达800公斤。不过，近年育成新品种（组合）的综合性状尚不尽如人意，其米质和抗性尚有待于进一步提高；换句话说，目前的超级稻在原有品质和抗性的基础上，实现了产量潜力的突破，这仅仅体现了狭义的超级稻概念。要实现产量潜力、抗性和米质的全面提高，也即广义的超级稻概念，现有常规技术已显得不足，超级稻育种技术亟需分子技术来提升。

    在过去的十几年中，水稻基因组研究取得了突飞猛进的进展，建立了致密的分子连锁图，定位了大量控制重要性状的主效和微效基因，克隆了控制白叶枯病抗性、稻瘟病抗性、株高、生育期、分蘖等重要性状的功能基因，基本完成了全基因组DNA序列的精细测定，功能基因组研究也已全面展开。随着水稻基因组研究的发展，分子育种技术在水稻育种应用中逐步得到发展和完善。

    所谓分子育种，指的是在经典遗传学和现代分子生物学、分子遗传学理论指导下，将现代生物技术手段整合于经典遗传育种方法中，结合表现型和基因型筛选，培育优良新品种。目前，水稻分子育种研究主要包括基因工程育种和分子标记辅助选择，其核心仍然是经典育种手段和方法；同时，由于分子生物学研究方法及其技术的应用，研究目的性和研究效率得到提高，原有的种间生殖隔离得到一定程度的打破，显示了明显的优越性。我国转基因水稻研究已开展多年，具有较强的技术储备，但其商品化应用尚待时日；水稻分子标记辅助选择的育种应用则已开展多年，育成品种已开始在生产上应用。本文将以中国水稻研究所开展的超级杂交稻分子标记辅助育种及其相关研究为重点，介绍我国水稻分子标记辅助育种的进展概况。

1 超级杂交稻分子育种基础研究

1.1 水稻籼粳特异性DNA标记筛选

    籼稻和粳稻是亚洲栽培稻的两个亚种。通过籼粳交能提高杂种的产量潜力。超级杂交稻育种亲本选配理论研究表明，籼粳中间型亲本能最大限度地协调杂种产量潜力的提高与株型配置的统一。因此，籼粳属性是超级杂交稻育种亲本选配的重要依据之一。早期籼粳属性的鉴别主要应用形态指标，其中以我国研究者提出的程氏指数应用最广泛。DNA标记的发展为水稻籼粳属性的鉴别提供了一种更为高效、准确的技术。

    在几种常用的DNA标记中，RFLP（限制性片段长度多态性）和SSLP标记（简单序列长度多态性，又称微卫星标记）均具有重演性高、一般呈共显性遗传等优点，但RFLP标记检测技术较复杂、费用高、花时长，难以满足一般育种研究的需求，而微卫星标记则检测快速、简便。第一张水稻RFLP标记连锁框架图发表于1988年，并在1994年发表了致密连锁图，而第一张水稻微卫星标记连锁框架图直到2000年才发表；与此相对应，我们开展的水稻籼粳特异性DNA标记的筛选工作，也经历了从RFLP标记到微卫星标记的过程。

    在应用RFLP标记分析水稻材料遗传多样性的研究中，我们发现部分RFLP标记具有特殊的籼粳分化表现，各籼稻材料具有一种带型，各粳稻材料具有另一种带型。这种类型的标记称之为籼粳特异性标记，可有效地鉴别水稻材料的籼粳属性。最初的研究筛选出13个籼粳特异性探针，并参考前人方法建立了计算籼粳指数的方法；这套探针对水稻材料籼粳属性的鉴别能力，在多个研究中得到验证。

    在后续工作中，基于95个对水稻品种间差异具有较高检测能力的RFLP探针，应用85份水稻品种（其中籼54份、粳31份）进一步分析，选得28个分布于12条水稻染色体的籼粳特异性探针 (表1)，以籼粳交加倍单倍体（DH）和重组自交系（RIL）群体为材料，分析了形态分类法与分子标记分类法对籼粳属性判别的典型相关性。结果显示，形态指数与标记座位有着非常密切的关系，前4对典型变量的典型相关系数均达到极显著水平（表2），表明籼粳特异性分子标记能为超级杂交稻育种中亲本籼粳属性的检测提供简便、快速和可信的技术。为适应水稻育种应用的需求，我们又进一步筛选出21个分布于12条水稻染色体上的籼粳特异性微卫星标记，并应用于超级杂交稻亲本籼粳属性的检测。

1.2 产量及相关性状QTL定位和杂种优势机理研究

    QTL（数量性状座位）分析是在基因组研究基础上发展起来的、应用分子标记连锁图谱剖析控制复杂性状的孟德尔因子的一个重要研究领域。我国是世界上开展水稻产量性状QTL研究最早、且最广泛的国家之一，并提出了开展分子标记辅助改良水稻产量潜力的技术途径。近年来，我们应用我国大面积推广的杂交稻组合汕优10号和协优46的亲本，配置珍汕97B/密阳46和协青早B/密阳46组合，建立F2、RIL及其相关回（测）交群体，构建遗传连锁图谱，检测控制水稻产量及其相关性状的QTL，为开展水稻产量性状的分子标记辅助选择提供依据。

1.2.1 QTL主效应和上位性效应的相互依赖性

    QTL的主效应和上位性效应分别反应了既定研究遗传背景下QTL本身的效应及其与其他座位相互作用所产生的效应，早期QTL研究受分析方法所限，很少检测到上位性效应；近年的研究则显示，上位性作用对产量等复杂性状的遗传控制具有重要的作用。

    在我们应用珍汕97B/密阳46和协青早B/密阳46衍生群体开展的研究中，涉及产量性状、形态性状（株高、叶片性状等）、抗逆性（耐旱性、抗倒性等）、物质含量（叶绿素含量、硅含量等）等多方面性状，主效应和上位性效应对研究性状均具有重要的作用，两类效应相互影响，其相对重要性依不同性状而异，但总体上以主效应为主。这里仅就珍汕97B/密阳46 RIL群体的产量性状QTL检测结果，作个简要说明。该研究分析了6个产量性状，一般而言，QTL的主效应对研究群体产量性状的遗传控制具有最重要的作用，上位性作用较弱，上位性作用与环境的互作效应最弱（表3）。比较QTL的两类遗传效应（即主效应vs上位性效应）、以及具有不同亲本遗传差异性群体的QTL研究报道，发现控制产量性状的QTL本身可能同时兼备两种效应，在一个具体的研究中，是同时显示两种效应，还是显示其中的一种效应，是显示主效应，还是显示上位性效应，与遗传背景和环境条件有关，特别是遗传背景。一般而言，遗传背景越复杂，越倾向于表现上位性作用；遗传背景越一致，越倾向于表现主效应。

1.2.2 超显性和上位性效应对水稻杂种优势的重要作用

    水稻杂种优势遗传机理研究是水稻QTL分析的重要应用领域之一。继Xiao等提出显性作用是水稻杂种优势的主要遗传基础之后，Yu等发现基因型×基因型互作是水稻杂种优势的重要遗传基础，Li等和Luo等进一步提出上位性座位的超显性作用是水稻杂种优势的首要遗传基础。

    在我们应用珍汕97B/密阳46和协青早B/密阳46 F2群体开展的研究中，为降低遗传背景对杂种优势遗传机理分析的干扰，提出亚群体分析法，在二个F2群体中，挑选均匀分布于连锁图谱的DNA标记作为固定因子，分别根据每个固定因子的基因型将F2群体分成三类亚群体：母本型（Ⅰ型）、父本型（Ⅱ型）和杂合型（Ⅲ型）。在大量Ⅲ型亚群体中，发现杂合度与产量和穗数呈显著正相关。相关QTL分析结果表明，在这些Ⅲ型亚群体中，检测到的产量QTL和穗数QTL往往表现出超显性作用。由此说明，杂种优势相关基因可能包括两种主要类型，一类可以在某些遗传背景下表现出超显性效应；另一类难以检测到超显性效应，但其杂合型状态是超显性QTL发挥效应的基础。因而提出，特定遗传背景下的超显性效应是水稻杂种优势的重要基础之一。

    比较杂种优势相关基因与育性恢复基因的基因组分布，发现两者具有极高的基因组位置一致性（表4），表明与恢复基因紧密连锁的产量性状基因或恢复基因本身，对水稻产量杂种优势的形成具有重要作用；比较株高性状和产量性状的田间表现和QTL定位结果，发现两类性状具有显著正相关，且其QTL在基因组位置、基因作用模式和效应方向诸方面具有较强的一致性，为“矮中求高”的高产育种策略提供了理论依据。

1.2.3 水稻特异基因组区域对产量遗传控制的重要作用

    目前，水稻产量性状QTL研究尚处于一般性的遗传图谱扫描分析，其结果基本处于假说状态，而产量性状的遗传控制又极其复杂，因而离直接育种应用尚有一定距离。尽管如此，水稻基因组存在一些这样的区间，它们在不同遗传背景、不同环境条件下都对农艺性状的遗传控制具有重要的作用，这些区间可以作为QTL精细定位、基因克隆和分子标记辅助选择的首选。

    比较我们各个研究的产量性状QTL定位结果，也发现若干表现稳定的区间，其中最突出的是第6染色体短臂微卫星标记RM204和RM276之间的基因组区域。综观前人报道，该区间也是表现最稳定的区间之一，检测到产量性状QTL的组合包括水稻籼粳交、中国水稻材料籼籼交、不同国家（生态类型）水稻籼籼交、水稻/旱稻等多种类型，遗传群体包括F2、加倍单倍体、重组自交系和回交（测交）群体等多种类型。同时，该区间的母本型纯合子（即珍汕97B纯合子和协青早B纯合子），具有超过其杂合子和父本型纯合子的增产效应，显示出应用分子标记辅助选择提高杂交稻产量的潜力。

    为进一步分析开展分子标记辅助选择改良水稻产量潜力的可行性，我们应用协青早B/密阳46的RIL群体，与协青早B、密阳46、9308配置了回（测）交群体，检测QTL并分析其遗传作用模式。研究不仅验证了前述研究中协青早B-密阳46遗传背景下RM204-RM276区间产量性状QTL的作用模式，而且还表明，协青早B/9308杂合子在该区间的增产能力远高于协青早B/密阳46杂合子，为协优9308（即协青早A/9308）的高产遗传基础提供了一定证据，并为开展分子标记辅助杂交稻高产育种提供了依据。

1.3 水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性分子标记辅助育种体系

    稻瘟病和白叶枯病是水稻，尤其是杂交水稻生产中的主要病虫害。据估计，单个病种平均每年有近10%的产量遭受损失。因此，稻瘟病抗性和白叶枯病抗性是超级杂交稻育种战略中不可忽视的主要方面。随着国内外对水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性遗传的系统研究，迄今已注册抗稻瘟病主基因25个、命名抗白叶枯病主基因20余个。在水稻分子标记辅助育种领域，抗病性状，尤其是白叶枯病抗性，是开展最为成功的性状，也是我国水稻分子标记辅助选择开展得最为广泛的性状。

    国际水稻研究所应用分子标记辅助选择，成功地将抗白叶枯病基因Xa-4、xa-5、xa-13和Xa-21以所有组合方式聚合到水稻恢复系IR24的遗传背景中。我们引入这套IRBB白叶枯病抗性基因聚合材料，鉴定了它们对浙江省4个主要流行白叶枯病小种的抗性，及时将这些材料引入育种计划，育成了R218和R8006等一系列抗病恢复系，并配组育成杂交稻新组合。

    在抗稻瘟病的分子标记辅助选择方面，国际水稻研究所也建立了筛选抗性基因的标记并应用于多抗性基因聚合材料的创建和育种应用中；在抗稻瘟病基因序列基础上发展起来的PCR标记，将进一步加速水稻抗稻瘟病分子标记辅助育种的开展。在近年抗稻瘟病基因定位研究中，我们选用我国特异抗稻瘟病资源谷梅2号与高产水稻品种中156配置组合，发展了由304个株系组成的RIL群体，构建了由176个标记组成个分子连锁图谱，将一个来自谷梅2号、兼抗叶瘟和穗瘟的主效基因定位在第6染色体上，将其暂命名为Pi-25(t)，将一个来自中156、仅抗叶瘟的基因定位在第12染色体上，将其暂命名为Pi-24(t)，并将Pi-25(t)两侧的RAPD标记转化为STS标记。应用从国际水稻研究所引入的、以及我们自己建立的抗稻瘟病基因聚合材料，和杂交稻亲本配置了组合，通过多代回交或应用单粒传法，获得多个高代群体，将应用分子标记辅助选择，选育聚合了抗稻瘟病基因和抗白叶枯病基因的恢复系。

2 超级杂交稻分子育种成效

2.1 育成超级杂交稻协优9308

    超级杂交稻协优9308的育成得益于应用籼粳特异性分子标记筛选中间型恢复系。对C57（粳）〃300号（粳）/IR26（籼）籼粳复交后代进行测交并结合籼粳特异标记检测，选育出籼粳中间型恢复系“R9308”，进而配制出杂交稻组合协优9308。协优9308克服了多年来籼粳杂种优势利用中杂种结实率偏低、籽粒灌浆差的难题，具有较高的产量水平和超高产潜力，抗稻瘟病和白叶枯病，米质优良，株型挺拔，青秆黄熟，是超级稻的一种新的株型模式。从1999年至2003年，连续5年在百亩、千亩连片上实现平均亩产700公斤以上，小面积亩产超800公斤的水平（表5）。截至2003年，协优9308已在全国累计推广1011万亩，取得了显著社会、经济和生态效益，2003年获中国农科院科技成果一等奖和浙江省科技进步一等奖。

2.2 育成优质、抗病恢复系R218、R8006及系列组合

    通过分子标记辅助选择与常规测恢相结合，从辐恢8383//辐恢838/IRBB21 BC3F1代的自交群体中育成强优恢复系R218；从L14//L1/IRBB60（L1为多系1号/R2070的杂交后代）BC4F1的自交群体中育成强优恢复系R8006。经接种验证和性状分析，两份恢复系均表现出良好的抗病性和优良的品质。已相继育成协优218、中优218、中9优218、中8优6号、中9优6号、II优8006等优质、高产、抗病组合。其中，协优218成为我国第一个通过省级审定的应用分子育种技术育成的杂交稻组合；中9优218、中8优6号和中9优6号也相继通过省级或国家级审定（表6），并因其高产、优质、抗性与优良株型的良好结合，由于受到了种业公司的追捧， 2005年生产推广面积将突破百万亩，充分显示出新品种的技术含量。

3 展望

    分子标记辅助选择已开始在水稻育种中发挥重要作用。水稻全基因组测序的完成和水稻功能基因组研究的开展，将为分子标记辅助选择提供取之不尽的标记资源，就如水稻微卫星标记数目急剧增加所显示的那样。标记本身已不成其为水稻分子标记辅助育种的限制因素，下一步的发展方向将是应用功能基因和候选基因的序列信息，发掘基于基因本身的PCR标记，以提高筛选效率和准确性。能否有效开展水稻分子标记辅助育种，更重要的在于是否具有基因组位置明确、遗传作用方式及其效应清楚的目的基因。

    在抗性育种研究方面，稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的分子标记辅助选择已初具规模。抗虫性和抗不良非生物胁迫基因定位研究相对薄弱，限制了其分子标记辅助选择的开展。与稻瘟病抗性和白叶枯病抗性相比，这些性状的传统鉴定一般难度更大、准确性更低，因而更需要借助标记辅助选择手段。特别是随着新株型超级稻品种的应用，对抗虫育种提出了更高的要求；自然环境的恶劣化，则使耐非生物逆境胁迫品种选育的重要性得到进一步提高。加强水稻抗虫性和抗不良非生物胁迫的遗传研究及其育种应用，势在必行。

    在稻米品质研究方面，虽然已开展了一些有益的尝试，但目前主要应用的与水稻Wx基因相关的标记，其筛选效果尚不能满足优质稻品种对稻米品质性状的要求，需要进一步发掘与其他品质性状相关的标记；在产量等复杂性状研究方面，则首先需要通过QTL的精细定位，确定各单个基因的准确位置和作用，挑选效应较大的基因，由简入繁，逐步深化。不管如何，水稻分子标记辅助选择具有广阔的应用前景，将随着相关研究的深入，逐步扩大应用范围，越来越紧密地整合于水稻育种实践中。